GB 4789.40-2024克羅諾桿菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)變更解讀

發(fā)布時(shí)間： 2024-04-19

克羅諾桿菌的簡(jiǎn)介

克羅諾桿菌（Cronobacter）是一種革蘭氏陰性的無(wú)芽孢短小桿菌，屬于腸桿菌科，是一種兼性厭氧的條件性致病菌。在顯微鏡下呈球桿狀或成對(duì)排列，有時(shí)也可呈短鏈狀，大小為（0.6μm-1.1μm）×（1.2μm-3.0μm），周身鞭毛，有動(dòng)力，廣泛分布于嬰幼兒配方粉、奶粉、奶酪、水果、蔬菜、肉制品以及自然環(huán)境中。

? ? ? ?克羅諾桿菌曾被認(rèn)為是產(chǎn)黃色素的陰溝腸桿菌，1980年法默等通過(guò)不同菌株之間的DNA雜交、生化、血清等特性，將其正式更名為阪崎腸桿菌，2008年又重新將其定義為克羅諾桿菌屬。該菌屬共包括7個(gè)種和3個(gè)亞種，即阪崎克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌（含有3個(gè)亞種：都柏林克羅諾桿菌都柏林亞種、都柏林克羅諾桿菌洛桑亞種、都柏林克羅諾桿菌乳粉亞種）、穆汀斯克克羅諾桿菌、丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌、康迪蒙提克羅諾桿菌和尤尼沃斯克羅諾桿菌。模式種為阪崎克羅諾桿菌，模式菌株為ATCC 29544。

克羅諾桿菌的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的更新

? ? ? ?在2024年2月8日頒布的GB 4789.40-2024版本中，在適用范圍中增加了嬰幼兒輔助食品，即新標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方食品、?嬰幼兒輔助食品、乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌的檢驗(yàn)。

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（圖片來(lái)源于GB4789.40-2024）

克羅諾桿菌定性檢驗(yàn)

1.?前增菌和增菌

? ? ? ?取檢樣100 g(mL) 置無(wú)菌容器中, 加入900 mL 已預(yù)熱至41℃±1℃?的緩沖蛋白胨水用手緩緩地?fù)u動(dòng)至充分溶解,36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)18 h±2 h。移取1 mL 轉(zhuǎn)種于10 mL mLST-Vm 肉湯，41.5℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h。

? ? ? ?由于取樣量較大，如用到剪刀勺子等工具，需提前高壓滅菌，也可以使用無(wú)菌的大均質(zhì)袋來(lái)進(jìn)行前增菌，便于節(jié)省空間。培養(yǎng)時(shí)，需防止均質(zhì)袋翻倒造成液體溢灑及封口不當(dāng)發(fā)生污染。

BPW預(yù)熱至41℃±1℃有助于粉狀樣品充分溶解，也避免了因液體較多升溫較慢引起的增菌失敗。必要時(shí)，可拍打均質(zhì)袋使粉狀樣品充分溶解混勻，BPW相較于無(wú)菌生理鹽水等能更好地使受損或缺乏營(yíng)養(yǎng)的細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)。

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BPW

? ? ? ? 克羅諾桿菌屬具有較強(qiáng)的耐滲透壓能力和較好的耐熱性，且對(duì)萬(wàn)古霉素天然耐藥，因此使用的改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLST-Vm）肉湯在提供了良好營(yíng)養(yǎng)的條件下利用高濃度的氯化鈉和萬(wàn)古霉素，且在41.5℃±1℃培養(yǎng)，能有效的抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和其他不耐滲透壓、不耐熱的細(xì)菌生長(zhǎng)。之前2016版標(biāo)準(zhǔn)中44℃的選擇性增菌溫度，是因?yàn)樵摐囟扰cISO 22964-2006相同，但目前國(guó)際普遍認(rèn)為該溫度可能抑制部分受損傷的克羅諾桿菌生長(zhǎng)，容易導(dǎo)致污染樣品發(fā)生漏檢。?因此ISO 22964-2017已將選擇性增菌溫度由44 ℃±0.5 ℃修改為41.5 ℃±1 ℃，2024版的新標(biāo)準(zhǔn)也進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)整。

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mLST-Vm

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（圖片來(lái)源于GB4789.28-2024）

2. 分離

輕輕混勻?mLST-Vm 肉湯培養(yǎng)物, 各取增菌培養(yǎng)物1 環(huán), 分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板, 36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)24 h±2 h, 或按商品化培養(yǎng)基的要求條件進(jìn)行培養(yǎng)。

顯色培養(yǎng)基

目前北京陸橋有三款適用于克羅諾桿菌檢驗(yàn)的顯色培養(yǎng)基。由于標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定產(chǎn)品配方，客戶可根據(jù)需求任選其一。

ESM015 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI）：樣品干擾菌少時(shí)可選擇。
ESM016 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基：對(duì)樣品中的干擾菌有更好的選擇性和分辨性。
ESM020 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基（CCI）：ISO22964-2017標(biāo)準(zhǔn)中CCI瓊脂。

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ATCC 29544阪崎克羅諾桿菌在三種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

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樣品分離干擾菌在三種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

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? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?注：CCI在實(shí)際表現(xiàn)中與DFI相近

每個(gè)平板挑取至少5 個(gè)可疑菌落, 不足5個(gè)時(shí)挑取全部可疑菌落, 劃線接種于 TSA 平板。36?℃ ±1 ℃培養(yǎng)24?h±2?h。

有文獻(xiàn)報(bào)道和相關(guān)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，部分克羅諾桿菌不產(chǎn)黃色素，因此在新標(biāo)準(zhǔn)中，刪除了黃色素的生化鑒定項(xiàng)目。

3.鑒定

自TSA平板上直接挑取可疑菌落, 進(jìn)行生化鑒定?？肆_諾桿菌屬的主要生化特征見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)中的表3?？蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。新標(biāo)準(zhǔn)中，刪除了苦杏仁苷生化項(xiàng)目。

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4. 分子生物學(xué)檢測(cè)

隨著乳制品生產(chǎn)企業(yè)和相關(guān)監(jiān)管部門對(duì)檢測(cè)方法時(shí)效性和準(zhǔn)確性需求的日益迫切，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法雖然準(zhǔn)確可靠，但操作繁瑣、工作量大、耗時(shí)較長(zhǎng)，已不能滿足快檢的要求。而分子生物學(xué)的檢測(cè)方法，由于其具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高且快速的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)被逐漸引入到食品微生物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（例如GB 4789.6-2016）中。SN/T 1632.3-2013出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗(yàn)方法中就有關(guān)于克羅諾桿菌熒光PCR的檢測(cè)方法。在新的克羅諾桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中也增加了PCR鑒定的方法，將其作為選做內(nèi)容。

? ? ? 北京陸橋的MX-1301克羅諾桿菌屬核酸檢測(cè)試劑盒，采用熒光PCR的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)克羅諾桿菌屬的特異性基因進(jìn)行檢測(cè)，且含有內(nèi)標(biāo)基因，只根據(jù)其擴(kuò)增曲線即可進(jìn)行判定，簡(jiǎn)便快捷，可根據(jù)需求進(jìn)行菌液或菌落的鑒定，極大的豐富了克羅諾桿菌的鑒定手段。

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