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1. 介紹
牛奶中的黃曲霉毒素 M1 被認(rèn)為是劇毒物質(zhì),國際癌癥機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素M1列入一類致癌物清單中,歐盟規(guī)定其限量為0.05μg/kg。黃曲霉毒素M1可通過側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l進(jìn)行快速檢測,并通過 ELISA 進(jìn)行定量,檢測時間至少為15分鐘和90分鐘。由于免疫層析技術(shù)中免疫化學(xué)的局限性,為實現(xiàn)歐盟限量中的高靈敏度造成了障礙。因此,ELISA 檢測方法仍然是黃曲霉毒素 M1 定量篩選最可靠的方法。
2. 研究目的
此研究的目的是對比一種創(chuàng)新的免疫層析檢測和 ELISA 方法對牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的定量檢測能力。
3. 研究方法
指示型側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l由高親和力單克隆抗體、結(jié)合膠體金、一條化學(xué)修飾的半抗原測試線和一條抗體對照線組成。抗黃曲霉毒素 M1 使用正在申請專利的O.H.C.M.I.T 技術(shù)生產(chǎn)(半抗原載體摩爾濃度優(yōu)化型免疫原性技術(shù))。在小鼠免疫接種和雜交瘤制備完成后,篩選克隆并使用蛋白 G 柱純化。基于這些特異性抗體,創(chuàng)建了對稱型黃曲霉毒素M1側(cè)向?qū)游鰷y試產(chǎn)品(Symmetric M1),這款競爭性免疫測定產(chǎn)品,僅需10分鐘即可完成檢測,且樣品無需前處理。黃曲霉毒素M1的濃度由量化系統(tǒng) S-Flow 分析得出。S-Flow系統(tǒng)使用新型對稱量化技術(shù),正在申請專利。掃描系統(tǒng)由 Lateral Logic有限公司提供。用于側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l測定的所有樣品(產(chǎn)品信息:Symmetric M1黃曲霉毒素檢測試紙條,S2196,批號S2196006,由 Prognosis Biotech S.A.股份有限公司提供)同時使用 ELISA 試劑盒進(jìn)行測定(產(chǎn)品信息:Bio-Shield M1 ES,B2096,批號B2096040,由Prognosis Biotech S.A. 股份有限公司提供)。
4. 研究結(jié)果
此研究中的 ELISA 試劑盒使用受控包被工藝,抗體具有穩(wěn)定的結(jié)合活性和較高特異性的特點,具有低基質(zhì)效應(yīng)和較優(yōu)的回收水平。在 2013-2017年多次奶或奶酪環(huán)測試(Ring Test)結(jié)果中,Z分?jǐn)?shù)的平均值為-0.0087(圖1)。
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圖1: 2013-2017 年度奶或奶酪環(huán)測試中 Z 分?jǐn)?shù)水平
在均質(zhì)牛奶(CHM),牛奶原奶(CRM),山羊奶原奶(GRM)和綿羊奶原奶(SRM)四種奶樣品中添加五種不同水平濃度的 AFM1(12.5、25、37.5、50、75ppt)作檢測分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)每種奶樣品在 ELISA和側(cè)向?qū)游鰴z測中的回收率平均值幾乎相同。具體來看,ELISA檢測的平均回收率分別為97.6%、98.4%、102.5%和100.7%,側(cè)向?qū)游鰴z測分別為97.9%、97.5%、97.3%和 98.0%(圖2)。
圖2: ELISA和側(cè)向?qū)游鰧Σ煌瑯悠分刑砑硬煌瑵舛赛S曲霉毒素M1檢測的回收率水平
以上結(jié)果通過檢測上述樣品中不同濃度的黃曲霉毒素 M1(表1)和參考物質(zhì)(圖3)得到證實。2017年在AIA 環(huán)測試中(注 AIA:意大利育種協(xié)會,管理意大利所有肉產(chǎn)品和奶產(chǎn)品的生產(chǎn))對乳制品中黃曲霉毒素M1檢測,Bio-Shield M1 ELISA試劑盒(61號)和Symmetric M1側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(98號)分別在99個參加者中排名第2(Z分?jǐn)?shù):0.04)和第5(Z分?jǐn)?shù):0.2)(表2)(圖4)。在5名側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l參加者中,Symmetric M1 排名第1(圖5)。
圖3: ELISA 和側(cè)向?qū)游鰴z測參考物質(zhì)的回收率水平
表 1: 相對偏差(%) (ELISA結(jié)果(ppt)/側(cè)向?qū)游鼋Y(jié)果(ppt)
表2: 2017年9月乳品中黃曲霉毒素M1 AIA 環(huán)測試結(jié)果RT M1 260917
圖4: 2017年9月乳品中黃曲霉毒素M1 AIA 環(huán)測試RT M1 260917 所有參加者 Z-分?jǐn)?shù)結(jié)果
圖5: 2017年9月黃曲霉毒素M1 AIA環(huán)測試RT M1 260917中側(cè)向?qū)游鰠⒓诱?Z-分?jǐn)?shù)
高親和力抗體和高級定量系統(tǒng)的結(jié)合有助于獲得較大范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)掃描設(shè)備的結(jié)果,ELISA 和側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l的曲線圖以及回收率水平幾乎相同。
5. 結(jié)論
??? 該創(chuàng)新的對稱型側(cè)向?qū)游龇椒ㄊ菣z測乳制品中黃曲霉毒素 M1快速定量檢測方法中最準(zhǔn)確的工具,其結(jié)果可與定量 ELISA 結(jié)果相媲美。
2018年8月 Bio-Shield M1 ES試劑盒及Symmetric M1定量試紙條通過ILVO驗證(ILVO: Flanders research institute for agriculture, fisheries and food. Technology and Food Science unit, Belgium.比利時弗拉芒農(nóng)業(yè)漁業(yè)和食品研究所,被譽為歐洲的AOAC)。
ILVO 研究報告
S-Flow 分析系統(tǒng)