想了解哪些食品易受蠟樣芽孢桿菌的污染嗎？想知曉國內外關于蠟樣芽孢桿菌的限量標準嗎？想掌握蠟樣芽孢桿菌檢驗關鍵環(huán)節(jié)--蛋白質毒素結晶的染色方法嗎？這篇文章會給你想要的答案。

蠟樣芽孢桿菌簡介

?????蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是芽孢桿菌屬的一員，為兼性厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，廣泛存在于土壤、塵埃、空氣和植物等自然環(huán)境中。

查閱文獻發(fā)現易受蠟樣芽孢桿菌污染的食品包括米飯或淀粉類制品、乳制品、水果制品等。值得注意的是，該菌污染的食物在感官上無明顯變化，不易被察覺，當在食物中大量繁殖產生腸毒素被誤食時會引起食物中毒，表現為惡心嘔吐或腹痛腹瀉。據統(tǒng)計我國1973-2013年的食物中毒事件中，由蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件占比12.95%，位居第二。

在日常飲食中為了保障食品安全，在室溫較高時，米飯及淀粉制品應選擇冷藏保存，避免蠟樣芽孢桿菌的繁殖。此外，生食的蔬菜和水果應認真清洗后食用。

蠟樣芽孢桿菌的限量標準和檢驗標準?

目前，我國大陸地區(qū)缺乏即食食品中蠟樣芽孢桿菌的限量標準。下表列出其他國家、中國香港和澳門地區(qū)的限量要求，希望為您制定產品的限量標準提供技術依據。澳大利亞和新西蘭標準可接受水平為10²~10³?CFU/g，英國和中國香港標準可接受水平為10³~10⁵CFU/g，中國澳門標準可接受水平為10³~10⁴?CFU/g。

我國食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗依照標準GB 4789.14-2014《食品安全國家標準?食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》進行，包括平板計數法和MPN計數法，主要檢驗步驟為樣品稀釋、接種、分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)、染色鏡檢和生化鑒定。

有文獻報道稱，蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）和炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）具有高度的DNA同源性，共同構成了蠟樣芽孢桿菌群（Bacillus cereus?group species），在形態(tài)學和生理生化反應方面極其相似，如此便為蠟樣芽孢桿菌的鑒定帶來了難度。

無論選擇生化鑒定試劑盒還是全自動細菌鑒定系統(tǒng)（如VITECK-2）進行蠟樣芽孢桿菌的鑒定，若要區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽胞桿菌，均需進行蛋白質毒素結晶試驗。產生蛋白質毒素晶體是蘇云金芽孢桿菌區(qū)別其他芽孢桿菌的重要依據。蘇云金芽孢桿菌是當前研究最為深入、應用最為廣泛的微生物農藥，其殺蟲的機理就在于芽孢形成期產生的具有殺蟲活性的蛋白質毒素結晶，昆蟲食入后，引起腸道細胞發(fā)生腫脹或自溶，導致蟲體死亡。

蛋白質毒素結晶染色方法?

?

接下來就是介紹蛋白毒素結晶染色方法和心得體會的時候了。

01?菌株的培養(yǎng)

將待鑒定菌株接種于硫酸錳營養(yǎng)瓊脂平板上，30?℃±1?℃培養(yǎng)24 h±2 h。

02?室溫放置

?

將培養(yǎng)物于室溫放置3 d~4 d，待芽孢和蛋白質毒素結晶的形成。若染色發(fā)現游離芽孢形成的不豐富，可繼續(xù)放置2 d~3 d再染色鏡檢。

將培養(yǎng)物逐天染色鏡檢發(fā)現，放置至D5時，觀察到游離芽孢和蛋白質毒素結晶，但不豐富，需切換視野進行尋找。隨著放置時間延長，蛋白質毒素結晶逐漸豐富。直到放置至D10，視野中布滿了蛋白質毒素結晶。不同菌株間在芽孢和蛋白質毒素結晶形成時間上存在差異。

?

03?染色

?

A? 挑取少量培養(yǎng)物于載玻片上，滴加一滴蒸餾水混勻并涂成薄膜（同革蘭氏染色）。

B? 經自然干燥，微火固定（同革蘭氏染色）。

C? 加甲醇作用30 s后傾去，再通過火焰干燥。

D? 于載玻片上滴滿0.5%堿性復紅，用鑷子夾取載玻片放于酒精燈火焰上加熱1 min～2 min。

控制好載玻片與火焰的距離，以達到“微見蒸汽，勿使染液沸騰”的效果。若加熱過度，染液干涸在載玻片上，后續(xù)難以徹底清洗，不利于鏡檢觀察。嘗試滴加染液后于室溫放置30 min，染色效果滿意，若把握不好加熱效果，此方法值得一試。

E? 傾倒染液，更換染液后再次加溫30 s，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干。

04?鏡檢

鏡檢觀察有無游離芽孢（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白質毒素結晶。除蘇云金芽孢桿菌外，其他芽孢桿菌不產生蛋白質毒素結晶。下圖中紅色箭頭標記為蛋白質毒素結晶，藍色箭頭標記為游離芽胞，黃色箭頭標記為菌體。

蘇云金芽孢桿菌蛋白質毒素結晶染色鏡檢（放置5天和10天）

?

參考文獻

1. 柳增善,任洪林,孫鴻斌.食品病原微生物學[M].北京:科學出版社,2015

2. Yang Liu, Qiliang Lai, et a1. Genomic insights into the taxonomic status of the Bacillus cereus group[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 14082．

3.?柳增善,任洪林,孫鴻斌.食品病原微生物學[M].北京:科學出版社,2015.

4.?劉芳,?蘭全學,李碧芳,?等.?國內外即食食品微生物限量標準解析[J].?食品與生物技術學報, 2017, 36(2): 215-223.

5. Rasko D A, Altherr MR, Han CS, et al. Genomics of the?Bacillus cereus?group of organisms[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2005, 29(2): 303-329.

6. David A. Rasko, Michael R. Altherr, et al. Genomics of the Bacillus cereus group of organisms. FEMS Microbiology Reviews 29 (2005) 303–329.

6.?關雄，蔡峻.?我國蘇云金桿菌研究60年[J].?微生物學通報，2014，41(3)：459-465.

7.?國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 4789.14-2014?食品安全國家標準.?食品微生物學檢驗?蠟樣芽孢桿菌檢驗[S].?北京:?中國標準出版社，2014.