想了解哪些食品易受蠟樣芽孢桿菌的污染嗎?想知曉國(guó)內(nèi)外關(guān)于蠟樣芽孢桿菌的限量標(biāo)準(zhǔn)嗎?想掌握蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)--蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶的染色方法嗎?這篇文章會(huì)給你想要的答案。
蠟樣芽孢桿菌簡(jiǎn)介
?????蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是芽孢桿菌屬的一員,為兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌,廣泛存在于土壤、塵埃、空氣和植物等自然環(huán)境中。
查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)易受蠟樣芽孢桿菌污染的食品包括米飯或淀粉類制品、乳制品、水果制品等。值得注意的是,該菌污染的食物在感官上無(wú)明顯變化,不易被察覺(jué),當(dāng)在食物中大量繁殖產(chǎn)生腸毒素被誤食時(shí)會(huì)引起食物中毒,表現(xiàn)為惡心嘔吐或腹痛腹瀉。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)1973-2013年的食物中毒事件中,由蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件占比12.95%,位居第二。
在日常飲食中為了保障食品安全,在室溫較高時(shí),米飯及淀粉制品應(yīng)選擇冷藏保存,避免蠟樣芽孢桿菌的繁殖。此外,生食的蔬菜和水果應(yīng)認(rèn)真清洗后食用。
蠟樣芽孢桿菌的限量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)?
目前,我國(guó)大陸地區(qū)缺乏即食食品中蠟樣芽孢桿菌的限量標(biāo)準(zhǔn)。下表列出其他國(guó)家、中國(guó)香港和澳門地區(qū)的限量要求,希望為您制定產(chǎn)品的限量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)依據(jù)。澳大利亞和新西蘭標(biāo)準(zhǔn)可接受水平為102~103?CFU/g,英國(guó)和中國(guó)香港標(biāo)準(zhǔn)可接受水平為103~105CFU/g,中國(guó)澳門標(biāo)準(zhǔn)可接受水平為103~104?CFU/g。
我國(guó)食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)依照標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.14-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)?食品微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》進(jìn)行,包括平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法,主要檢驗(yàn)步驟為樣品稀釋、接種、分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)、染色鏡檢和生化鑒定。
有文獻(xiàn)報(bào)道稱,蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)和炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)具有高度的DNA同源性,共同構(gòu)成了蠟樣芽孢桿菌群(Bacillus cereus?group species),在形態(tài)學(xué)和生理生化反應(yīng)方面極其相似,如此便為蠟樣芽孢桿菌的鑒定帶來(lái)了難度。
無(wú)論選擇生化鑒定試劑盒還是全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(如VITECK-2)進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌的鑒定,若要區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽胞桿菌,均需進(jìn)行蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)。產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素晶體是蘇云金芽孢桿菌區(qū)別其他芽孢桿菌的重要依據(jù)。蘇云金芽孢桿菌是當(dāng)前研究最為深入、應(yīng)用最為廣泛的微生物農(nóng)藥,其殺蟲(chóng)的機(jī)理就在于芽孢形成期產(chǎn)生的具有殺蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶,昆蟲(chóng)食入后,引起腸道細(xì)胞發(fā)生腫脹或自溶,導(dǎo)致蟲(chóng)體死亡。
蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶染色方法?
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接下來(lái)就是介紹蛋白毒素結(jié)晶染色方法和心得體會(huì)的時(shí)候了。
01?菌株的培養(yǎng)
將待鑒定菌株接種于硫酸錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,30?℃±1?℃培養(yǎng)24 h±2 h。
02?室溫放置
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將培養(yǎng)物于室溫放置3 d~4 d,待芽孢和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶的形成。若染色發(fā)現(xiàn)游離芽孢形成的不豐富,可繼續(xù)放置2 d~3 d再染色鏡檢。
將培養(yǎng)物逐天染色鏡檢發(fā)現(xiàn),放置至D5時(shí),觀察到游離芽孢和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶,但不豐富,需切換視野進(jìn)行尋找。隨著放置時(shí)間延長(zhǎng),蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶逐漸豐富。直到放置至D10,視野中布滿了蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶。不同菌株間在芽孢和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶形成時(shí)間上存在差異。
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03?染色
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A? 挑取少量培養(yǎng)物于載玻片上,滴加一滴蒸餾水混勻并涂成薄膜(同革蘭氏染色)。
B? 經(jīng)自然干燥,微火固定(同革蘭氏染色)。
C? 加甲醇作用30 s后傾去,再通過(guò)火焰干燥。
D? 于載玻片上滴滿0.5%堿性復(fù)紅,用鑷子夾取載玻片放于酒精燈火焰上加熱1 min~2 min。
控制好載玻片與火焰的距離,以達(dá)到“微見(jiàn)蒸汽,勿使染液沸騰”的效果。若加熱過(guò)度,染液干涸在載玻片上,后續(xù)難以徹底清洗,不利于鏡檢觀察。嘗試滴加染液后于室溫放置30 min,染色效果滿意,若把握不好加熱效果,此方法值得一試。
E? 傾倒染液,更換染液后再次加溫30 s,傾去染液用潔凈自來(lái)水徹底清洗、晾干。
04?鏡檢
鏡檢觀察有無(wú)游離芽孢(淺紅色)和染成深紅色的菱形蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶。除蘇云金芽孢桿菌外,其他芽孢桿菌不產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶。下圖中紅色箭頭標(biāo)記為蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶,藍(lán)色箭頭標(biāo)記為游離芽胞,黃色箭頭標(biāo)記為菌體。
蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶染色鏡檢(放置5天和10天)
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