2.靛基質(zhì)、尿素酶和氰化鉀生長(zhǎng)試驗(yàn)
如果初步判斷符合可疑沙門氏菌屬的生化結(jié)果時(shí)，挑取純化好的可疑菌落，再繼續(xù)做靛基質(zhì)、尿素酶和氰化鉀生長(zhǎng)試驗(yàn)，這三步試驗(yàn)也可與三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)同時(shí)做，36℃±1℃培養(yǎng)16h-24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48h，純化后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板儲(chǔ)存于2℃-5℃或室溫至少保留24h，以便進(jìn)行后續(xù)的生化試驗(yàn)和必要時(shí)復(fù)查。
2.1靛基質(zhì)試驗(yàn)
將純化后的可疑菌株接種至蛋白胨水中，36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h，培養(yǎng)后沿管壁緩慢的加入柯凡克試劑或歐-波試劑，若此可疑菌株可分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚與靛基質(zhì)試劑中的對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的玫瑰吲哚，為陽(yáng)性；若不分解色氨酸則仍是黃色，為陰性。
2.2尿素酶試驗(yàn)
某些細(xì)菌產(chǎn)生的尿素酶分解尿素可產(chǎn)生大量的堿性物質(zhì)-氨，使培養(yǎng)基pH值升高，指示劑酚紅變成紅色，為陽(yáng)性；
在試驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)待滅菌后的尿素瓊脂基礎(chǔ)冷卻至55℃時(shí)，再每95mL基礎(chǔ)中加入5mL 40%尿素水，防止基礎(chǔ)溫度過(guò)高使尿素水分解，充分混勻后分裝試管，制成斜面。
2.3氰化鉀試驗(yàn)
該試驗(yàn)的目的是為了鑒別細(xì)菌能否被一定濃度的氰化鉀抑制而導(dǎo)致細(xì)菌不生長(zhǎng)；若試驗(yàn)管生長(zhǎng)渾濁為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)且澄清的為陰性。
注意??在進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)將同一株可疑菌同時(shí)接種氰化鉀對(duì)照管和試驗(yàn)管各一支；
氰化鉀試驗(yàn)操作時(shí)易失敗的主要原因：
????在氰化鉀對(duì)照管和試驗(yàn)管接種可疑菌株后，應(yīng)使用無(wú)菌的液體石蠟覆蓋液面，若不覆蓋，氰化鉀會(huì)逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致氰化鉀濃度降低，細(xì)菌生長(zhǎng)，造成假陽(yáng)性的結(jié)果。
氰化鉀為劇毒物質(zhì)，可抑制呼吸酶，造成細(xì)胞內(nèi)窒息，吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收均可引起急性中毒，在操作該試驗(yàn)時(shí)應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)，避免接觸、入口或吸入。
廢棄處理???試驗(yàn)結(jié)果觀察結(jié)束后，在每管中加入0.5mL的40%氫氧化鉀溶液和數(shù)粒硫酸亞鐵，反應(yīng)數(shù)小時(shí)后，建議121℃高壓滅菌30min，廢棄。
2.4生化結(jié)果鑒定
根據(jù)以上的試驗(yàn)結(jié)果，查詢表3對(duì)沙門氏菌屬進(jìn)行初步鑒定：
反應(yīng)序號(hào)A1：
當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果符合A1時(shí)，為沙門氏菌屬的典型反應(yīng)，生化結(jié)果可初步判定為沙門氏菌；
若此表格中，有1項(xiàng)不符合時(shí)，再參考表4中的“判定結(jié)果”再進(jìn)行血清或生化的驗(yàn)證試驗(yàn)；
若有2項(xiàng)結(jié)果不符合時(shí)，判定為非沙門氏菌。
表4判定結(jié)果解讀：
若試驗(yàn)結(jié)果為第1種情況時(shí)，生化結(jié)果初步鑒定為甲型副傷寒沙門氏菌，需通過(guò)查詢WKLM抗原表，確定甲型副傷寒沙門氏菌的O抗原和H抗原的因子，再進(jìn)行血清學(xué)的驗(yàn)證試驗(yàn)。
若試驗(yàn)結(jié)果為第2種情況時(shí)，生化結(jié)果初步鑒定為沙門氏菌IV或V，若需分清是IV還是V，就需要按照表5做相應(yīng)的生化試驗(yàn)再進(jìn)行分群，最終的鑒定還需要參考血清學(xué)鑒定的結(jié)果共同確定。
反應(yīng)序號(hào)A2：
?當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果符合A2時(shí)，需要再做甘露醇和山梨醇兩項(xiàng)試驗(yàn)，若補(bǔ)做的甘露醇和山梨醇均為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，繼續(xù)做血清學(xué)鑒定試驗(yàn)，結(jié)合血清學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定；
反應(yīng)序號(hào)A3：
當(dāng)試驗(yàn)結(jié)果符合A3時(shí)，需補(bǔ)做ONPG試驗(yàn)；
若賴氨酸脫羧酶為陽(yáng)性，ONPG為陰性時(shí)生化結(jié)果初步判定為沙門氏菌；
若賴氨酸脫羧酶和ONPG的結(jié)果均為陰性時(shí)，生化結(jié)果初步判定為甲型副傷寒沙門氏菌。
以上部分為單獨(dú)做每項(xiàng)生化的操作和結(jié)果判讀，但是操作較繁瑣易出錯(cuò)，建議使用DBI-05沙門氏菌的生化鑒定試劑盒操作，參考說(shuō)明書(shū)，流程簡(jiǎn)單幾步完成，結(jié)果易觀察，減少出錯(cuò)率。
具體操作如下：
操作時(shí)的注意事項(xiàng)
1.??????DBI沙門氏菌生化鑒定試劑盒操作用的菌株，應(yīng)使用純化培養(yǎng)18-24h的新鮮菌株；
2.??????一定要在試劑盒的長(zhǎng)凹槽中加無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水，防止培養(yǎng)過(guò)程中菌懸液干燥，影響結(jié)果觀察；
3.??????調(diào)整0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙簳r(shí)，應(yīng)少量多次的加菌，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)0.5麥?zhǔn)蠞岫缺葷峁軐?duì)光比較；標(biāo)準(zhǔn)0.5麥?zhǔn)蠞岫缺葷峁芤欢ㄒ葥u勻再比較，是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)0.5麥?zhǔn)蠞岫缺葷峁苤形镔|(zhì)易沉淀，不搖勻則配置的菌懸液濃度不正確；
4.??????其他的操作參考DBI-05沙門氏菌生化鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)。
結(jié)果判定：需結(jié)合說(shuō)明書(shū)上的結(jié)果判定表和GB4789.4-2016進(jìn)行結(jié)果判定，具體判定方法參考文章上半部分。
血清學(xué)鑒定
血清學(xué)鑒定試驗(yàn)是必做的項(xiàng)目，血清學(xué)分型為選做項(xiàng)目可根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)室的需求選擇。
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備沙門氏菌多價(jià)菌體（O）和多價(jià)鞭毛（H）診斷血清。
1.??????沙門氏菌屬的抗原結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介
O抗原：也稱為菌體抗原，是細(xì)胞壁的組成成分，Ｏ抗原與抗血清的反應(yīng)呈顆粒狀；
H抗原：也稱為鞭毛抗原，不同細(xì)菌的Ｈ抗原具有特異性，常作為血清學(xué)鑒定的依據(jù)之一；Ｈ抗原與抗血清的反應(yīng)呈絮狀或絨狀，大部分沙門氏菌Ｈ抗原都有兩相，第一相被稱為特異性相，第二相為非特異性相；
Vi抗原：是一種特殊的菌體抗原，屬于K抗原群，如傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和都柏林沙門氏菌都含有Vi抗原。
2.??????培養(yǎng)物自凝性的檢查
在一塊潔凈的玻片上滴加一滴生理鹽水，挑取瓊脂量為1.2%-1.5%的培養(yǎng)基平板上純化的菌株，混合于生理鹽水滴中，混勻，成為均一性的混濁懸液，將玻片輕輕混動(dòng)30s-60s，置于黑色背景下觀察凝集情況，若出現(xiàn)可見(jiàn)的菌體凝集，則認(rèn)為有自凝性，說(shuō)明該菌株發(fā)生S-R變異，失去了O抗原成為粗糙型，不能進(jìn)行血清學(xué)鑒定試驗(yàn)；反之無(wú)自凝性，若無(wú)自凝性則繼續(xù)做后續(xù)的血清學(xué)試驗(yàn)。
注意?在做血清學(xué)鑒定試驗(yàn)中，菌株建議使用純化培養(yǎng)18-24h的新鮮菌株；
菌株純化時(shí)，建議使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，盡量不用平板計(jì)數(shù)瓊脂，是因?yàn)槠桨逵?jì)數(shù)瓊脂配方中含有糖類，糖類會(huì)干擾血清學(xué)的鑒定；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的瓊脂量在1.2%-1.5%之間。
3.??????O多價(jià)菌體抗原的鑒定
在潔凈的玻片的一邊滴加一滴生理鹽水作為對(duì)照，另一邊滴加一滴O多價(jià)血清；
自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板挑取1環(huán)純化后的待測(cè)菌，在生理鹽水滴和多價(jià)菌體（O）抗血清滴上方各放1/2環(huán)待測(cè)菌，再用無(wú)菌的接種環(huán)分別將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌苔研磨成乳液狀，將玻片輕輕混動(dòng)1min，置于黑色背景下觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽(yáng)性反應(yīng)。
注意??研磨菌株時(shí)應(yīng)先研磨生理鹽水區(qū)域，再研磨O多價(jià)血清區(qū)域；若先研磨O多價(jià)血清區(qū)域，再研磨生理鹽水區(qū)域，有可能會(huì)把O多價(jià)血清帶入到生理鹽水區(qū)域，造成誤判。
若O多價(jià)不凝集時(shí)就判定為非沙門氏菌嗎？
此時(shí)需要考慮是否因?yàn)榍v膜的原因而導(dǎo)致的O多價(jià)不凝集，分為以下兩步進(jìn)行排除：
I.???????將菌株接種在瓊脂量較高（2%-3%）的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，再進(jìn)行O多價(jià)凝集試驗(yàn)，這里說(shuō)的高瓊脂量的培養(yǎng)基，可以在實(shí)驗(yàn)室中，按每100mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（脫水干粉培養(yǎng)基）中加入1g的瓊脂，再高壓滅菌，倒平板備用。
在較高瓊脂量的培養(yǎng)基上再純化的原因：因?yàn)榫暝诃傊枯^高的培養(yǎng)基上莢膜發(fā)育不良，可以暴漏出O抗原，有利于檢測(cè)是否有菌體抗原存在；
II.??????若是因?yàn)橛蠽i抗原存在而阻止O凝集反應(yīng)時(shí)，可多挑取純化后的待測(cè)菌株置于1mL生理鹽水中制成濃菌液，煮沸，破壞莢膜的多糖和抗原，暴露O抗原，需要待菌液冷卻后再進(jìn)行O多價(jià)血清的鑒定。
4.??????H多價(jià)鞭毛抗原的鑒定
操作與O多價(jià)鑒定步驟相同；
但H抗原發(fā)育不良時(shí)，H多價(jià)血清也會(huì)不凝集，此時(shí)需要將菌株接種瓊脂量更低（0.55%-0.65%）的半固體瓊脂平板中央，培養(yǎng)后，菌株蔓延生長(zhǎng)至平板的邊緣時(shí)，取最邊緣的菌株進(jìn)行H多價(jià)血清凝集試驗(yàn)；
注意?若培養(yǎng)后菌株未蔓延生長(zhǎng)，則需要再次轉(zhuǎn)種半固體瓊脂培養(yǎng)基，直至蔓延生長(zhǎng)；
為什么H多價(jià)血清鑒定需要瓊脂量更低的半固體瓊脂平板？
因?yàn)镠多價(jià)血清的鑒定需要菌株的鞭毛發(fā)育良好，而培養(yǎng)基的瓊脂量更低時(shí)，含有的水分就越多，越有利于菌株鞭毛的發(fā)育和爬行。
促進(jìn)鞭毛發(fā)育的另一種方法是將菌株通過(guò)接種裝有0.3%-0.4%半固體瓊脂的小玻管1-2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查，該方法操作較復(fù)雜。
結(jié)果與報(bào)告
綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。
注意??報(bào)告結(jié)果不能只參考生化試驗(yàn)或血清學(xué)鑒定的結(jié)果，而應(yīng)該綜合考慮生化和血清學(xué)兩項(xiàng)的共同結(jié)果來(lái)判斷。